v
TÓM TẮT KHÓA LUẬN
Hồ Bửu Thông, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 8 / 2007. “Xây dựng
qui trình PCR phát hiện nấm Ustilago scitaminea gây bệnh than trên mía.” đề tài được
thực hiện từ tháng 5 đến tháng 8 năm 2007 tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hoá Sinh
thuộc Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Công nghệ Môi trường, Trường Đại học
Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
Giáo viên hƣớng dẫn: PGS. TS. Bùi Cách Tuyến.
Nội dung nghiên cứu
Nuôi cấy, phân lập, tách đơn bào tử và nhân sinh khối nấm Ustilago
scitaminea.
Xây dựng qui trình PCR phát hiện trực tiếp DNA sợi nấm Ustilago scitaminea.
Kết quả đạt đƣợc
Phân lập, tách đơn bào tử và nhân sinh khối 11 dòng nấm Ustilago scitaminea
từ 11 giống mía khác nhau ở Bình Dương.
Xây dựng được qui trình PCR phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm để phát
hiện nấm Ustilago scitaminea.
vi
SUMMARY
Ho Buu Thong studying at Nong Lam University and finishing the thesis on 8
th
, 2007.
The thesis entitled “Establishing a protocol PCR to detect Ustilago scitaminea causing
sugarcane smut”. This research was conducted from 5
th
, 2007 to 8
th
, 2007 at the
laboratory of biotechnology and chemistry of Nong Lam University.
Board of scientific instruction: Prof.Dr. BUI CACH TUYEN
The content of research:
Culturing, isolating, demorphisming the spore and multiplying the living mass
of Ustilago scitaminea.
Establishing a protocol PCR to detect Ustilago scitaminea.
The results obtained from this study:
Culturing, isolating, demorphisming the spore and multiplying the living mass
of 11 Ustilago scitaminea clonies.
A protocol PCR for detecting Ustilago scitaminea was established.
vii
MỤC LỤC
PHẦN TRANG
LỜI CẢM TẠ iv
TÓM TẮT v
SUMMARY vi
MỤC LỤC vii
DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT x
DANH SÁCH CÁC BẢNG xi
DANH SÁCH CÁC HÌNH xii
Chương 1: MỞ ĐẦU 1
1.1. Cơ sở tiến hành và ý nghĩa của nghiên cứu 1
1.2. Nội dung nghiên cứu 2
1.3. Yêu cầu 2
1.4. Giới hạn đề tài 2
Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Sơ lược về cây mía 3
2.1.1. Lịch sử phát hiện 3
2.1.2. Phân loại 3
2.1.3. Nguồn gốc và phân bố 4
2.1.4. Nhân giống 5
2.1.5. Sản lượng 5
2.1.6. Chế biến và sử dụng 5
2.1.7. Vị trí kinh tế của cây mía 6
2.1.8. Sản xuất protein tái tổ hợp từ mía 7
2.1.9. Bệnh trên cây mía 7
2.2. Bệnh than 8
2.2.1. Nguồn gốc và phân bố 8
2.2.2. Triệu chứng 9
2.2.3. Tác nhân gây bệnh 9
2.2.4. Đặc điểm phát sinh phát triển bệnh 10
viii
2.2.5. Thiệt hại về kinh tế 11
2.2.6. Biện pháp phòng trừ 11
2.3. Các phương pháp xác định bệnh than 11
2.3.1. Dựa vào triệu chứng 11
2.3.2. Phương pháp chẩn đoán bằng cách nhuộm mắt mầm và soi dưới kính hiển vi
huỳnh quang. 12
2.3.3. Phương pháp ELISA 12
2.3.4. Phương pháp PCR 12
2.4. Tình hình nghiên cứu bệnh than 21
2.4.1. Trên thế giới 21
2.4.2. Trong nước 23
Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24
3.1. Nội dung nghiên cứu 24
3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 24
3.3. Vật liệu nghiên cứu 24
3.4. Phương pháp tiến hành 24
3.4.1. Phương pháp lấy mẫu 24
3.4.2. Phương pháp phân lập 25
3.4.3. Phương pháp tách đơn bào tử 25
3.4.4. Phương pháp nhân sinh khối nấm 26
3.4.5. Phương pháp ly trích DNA tổng số của nấm Ustilago scitaminea 26
3.4.6. Tinh sạch sản phẩm ly trích 28
3.4.7. Phương pháp PCR phát hiện nấm Ustilago scitaminea 29
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32
4.1. Phân lập, tách đơn bào tử và nhân sinh khối nấm Ustilago scitaminea 32
4.1.1. Kết quả phân lập 32
4.1.2. Kết quả tách đơn bào tử 33
4.1.3. Kết quả nhân sinh khối 34
4.2. Kết quả ly trích và tinh sạch DNA sợi nấm 36
4.2.1. Kết quả ly trích 36
4.2.2. Kết quả tinh sạch 37
ix
4.3. Phát hiện DNA của Ustilago scitaminea bằng kỹ thuật PCR 39
Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43
5.1. Kết luận 43
5.2. Đề nghị 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO 44
PHỤ LỤC 47
x
DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT
bp : base pair
BLAST : Basic Local Alignment Search Tool
ctv : cộng tác viên
dNTP : deoxyribonucleotide – 5 – triphosphate
EDTA : Ethylene Diamine Tetracetic Acid
ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay
Kb : kilo base
m : micro mol
M : micro mol/lít
ng : nano gram
NST : nhiễm sắc thể
Nu : Nucleotide.
PCR : Polymerase Chain Reaction
PGA : Potato glucose agar
RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA
RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism
SDS : Sodium dodecyl sulphate
TAE : tris acetic EDTA
Taq : Thermus aquaticus
TE : tris EDTA
Tm : melting temperature
UI : unit international
UV : Ultraviolet
xi
DANH SÁCH CÁC BẢNG
BẢNG TRANG
Bảng 2.1: Thống kê các nhóm tác nhân gây bệnh và số lượng bệnh xảy ra
trên cây mía. 8
Bảng 2.2: Tỉ lệ nhiễm bệnh than của các giống mía ở Hawaii đối với nòi mới 23
Bảng 3.1: Thành phần môi trường PGA* 25
Bảng 3.2: Thành phần các chất trong phản ứng PCR và chu kỳ nhiệt 30
Bảng 4.1: Các dòng nấm được tách đơn bào tử 34
Bảng 4.2: Khối lượng sợi nấm sau 4 ngày lắc trong môi trường PGA* lỏng 35
Bảng 4.3: Nồng độ các yếu tố trong phản ứng PCR thay đổi 40
xii
DANH SÁCH CÁC HÌNH
HÌNH TRANG
Hình 2.1: Triệu chứng bệnh than trên mía 9
Hình 2.2: Bào tử nấm 10
Hình 4.1: Khuẩn lạc nấm Ustilago scitaminea sau 5 ngày nuôi cấy 32
Hình 4.2: Khuẩn lạc nấm Ustilago scitaminea sau 7 ngày nuôi cấy 33
Hình 4.3: Bào tử nấm Ustilago scitaminea. 33
Hình 4.4: Bào tử nấm nảy mầm trên môi trường agar soi dưới kính hiển vi
ở vật kính x 40 34
Hình 4.5: Sinh khối nấm sau 4 ngày lắc 35
Hình 4.6: Kết quả li trích DNA của 11 dòng nấm 36
Hình 4.7: DNA tổng số đã tinh sạch 38
Hình 4.8: DNA tổng số sau khi pha loãng 39
Hình 4.9: Sản phẩm PCR theo quy trình của Albert, H. H., và Schenck, S., 39
Hình 4.10: Sản phẩm PCR sau thay đổi đầu tiên 40
Hình 4.11: Sản phẩm PCR sau khi thay đổi nồng độ hóa chất và chu kỳ nhiệt 41
Hình 4.12: Sản phẩm PCR theo quy trình mới 41
1
Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1. Cơ sở tiến hành và ý nghĩa của nghiên cứu
Hiện nay cây mía (Saccharum spp.) đang là một trong những loại cây công nghiệp
cho hiệu quả kinh tế cao ở nước ta cũng như nhiều nước trên thế giới như Cuba, Ấn
Độ, Australia,.v.v vì vậy diện tích trồng mía cũng như sự ra đời của nhiều giống mới
không ngừng gia tăng trong những năm gần đây. Tuy nhiên mía là cây trồng một lần
nhưng lại có khả năng cho thu hoạch nhiều vụ, nên đây cũng là một trong những điều
kiện thuận lợi cho nhiều loại sâu bệnh gây hại tồn tại và phát triển (Nguyễn Huy Ước,
1994). Hơn nữa khi cơ cấu giống mía phong phú hơn, thời tiết khí hậu có nhiều biến
đổi cũng góp phần làm cho dịch bệnh đa dạng hơn. Các bệnh quan trọng ảnh hưởng
đến năng suất mía hiện nay có rất nhiều, trong đó phải kể đến bệnh than (smut).
Bệnh than do nấm Ustilago scitaminea gây ra, đây là bệnh rất phổ biến và có ảnh
hưởng lớn đến ngành sản xuất mía đường của nhiều nước trên thế giới. Do vậy việc
phát hiện bệnh than trên các giống mía có vai trò rất quan trọng, nhằm thống kê tình
hình nhiễm bệnh, nâng cao hiệu quả chọn lọc giống và kiểm soát bệnh.
Các phương pháp phát hiện Ustilago scitaminea như là nhuộm mắt mầm, phát hiện
bằng phương pháp miễn dịch học,.v.v nhưng độ chính xác và độ nhạy chưa cao. Do
vậy, việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phát hiện nhanh và chính xác
bệnh là một yêu cầu cần thiết, có ý nghĩa rất quan trọng, phục vụ cho công tác chọn
giống, kiểm định giống từ đó đề ra các khuyến cáo nhằm kiểm soát và quản lí bệnh có
hiệu quả.
Trước tình hình trên, được sự hướng dẫn của PGS. TS. Bùi Cách Tuyến và sự hỗ
trợ từ Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Mía Đường tỉnh Bình Dương, chúng tôi đã
thực hiện đề tài “Xây dựng qui trình PCR phát hiện nấm Ustilago scitaminea gây
bệnh than trên mía”. Đề tài được thực hiện trên 11 dòng nấm từ 11 giống mía khác
nhau thuộc tỉnh Bình Dương.
2
1.2. Mục đích nghiên cứu
Thu nhận khuẩn lạc nấm Ustilago scitaminea đồng nhất về mặt di truyền.
Khuếch đại đoạn gen bE nấm Ustilago scitaminea gây bệnh than trên mía, từ đó
đề ra phương pháp chẩn đoán sớm bệnh than bằng kỹ thuật PCR.
1.3. Yêu cầu
Nhận dạng được triệu chứng biểu hiện của bệnh than trên mía.
Nắm vững kỹ thuật nuôi cấy, tách đơn bào tử và nhân sinh khối nấm Ustilago
scitaminea.
Nắm vững kỹ thuật PCR.
1.4. Giới hạn đề tài
Thời gian thực hiện đề tài có hạn vì vậy không thể thực hiện phản ứng RFLP –
PCR để xác định tính đa dạng di truyền của các dòng nấm thu thập được.
Chưa giải trình tự vùng gene bE của nấm đã được khuếch đại.
Không có nhận xét nào:
Đăng nhận xét